Тематический каталог
Проведение ПЦР с HotTaq полимеразой
Наборы
Ферменты для мол. биологии
Дезокситрифосфаты
Праймеры и маркеры
Рестриктазы
Буфера и растворы
Реактивы для мол. биологии
Магнитные технологии
Автоматизация и роботы
Скачать каталог
Постановка ПЦР с "горячим стартом" на большинстве матриц дает улучшение результатов реакции приводя к более высокому выходу продукта, увеличению специфичности, отсутствию "нецелевых" продуктов. Постановка ПЦР с "горячим стартом" вручную усложняет весь процесс постановки реакции. Вначале требуется смешать все компоненты реакции за исключением фермента, а иногда и праймеров, прогреть реакционную смесь выше температуры отжига праймеров, и только затем добавить фермент (и праймеры, если их не добавляли) в горячую смесь и начать реакцию. Такая сложная процедура постановки приводила к тому, что в случае ПЦР для большого количества образцов (диагностический ПЦР), исследователи были вынуждены прибегать к ухищрениям, позволившим бы им упростить постановку и избежать отдельной процедуры добавления фермента. Результатом таких ухищрений стало: - использование легкоплавкого парафина или специального масла для отделения праймеров и фермента от реакционной смеси до момента ее полного прогрева (проблема - равномерное смешивание компонентов); - применение коротких нуклеотидных последовательностей, которые блокировали активный центр полимеразы и освобождали его при нагревании (проблема - низкая температура денатурации комплекса, что делает "горячий старт" в таком исполнении не таким эффективным); - применение антител к полимеразе, также блокирующих активный центр и денатурирующих после нагревания (проблема - качественная очистка антител от примесей эукариотической ДНК, что может приводить к неспецифической амплификации при использовании праймеров на последовательности эукариот). Теперь можно забыть обо всех этих проблемах. HotTaq полимераза неактивна до начала ПЦР. Поставить ПЦР с "горячим стартом" стало так же просто, как и обычный ПЦР. Вот только результат будет значительно лучше... ПЦР с HotTaq полимеразой шаг за шагом Чтобы наиболее эффективно использовать возможности HotTaq полимеразы рассмотрим основные факторы, которые влияют на проведение ПЦР и позволяют оптимизировать этот процесс. В обычном ПЦР, когда компоненты реакционной смеси смешиваются ниже температуры денатурации, может происходить неспецифический отжиг праймеров и в результате - образование неспецифического продукта и праймер-димеров. Неспецифические продукты, раз образовавшись, или на этапе смешивания, или в ходе первых циклов, будут амплифицироваться на протяжении всех оставшихся циклов ПЦР. Это приводит к уменьшению чувствительности эксперимента за счет ослабления амплифицируемого сигнала или маскировки его высоким фоном. Если избежать образования неспецифических продуктов, полимеразы работает только на образование целевого продукта, увеличивая тем самым специфичность и количество, и уменьшая неспецифический фон в амплификации. Чтобы повысить специфичность и чувствительность ПЦР применяют технику "горячего старта". "Горячий старт" - это модификация обычной постановки ПЦР, при которой ПЦР начинают при повышенной температуре, добавляя главные компоненты реакционной смеси только после того, как смесь прогрелась выше температуры отжига праймеров. Но при постановке ПЦР большого количества образцов этот подход становится достаточно трудоемким. HotTaq полимераза представляет собой химически модифицированную форму Taq полимеразы. Эта модицикация делает фермент неактивным. В процессе термической активации модификатор разрушается, приводя к активации фермента. Для активации HotTaq полимеразы необходима инкубация при высокой температуре, что гарантирует образование активного фермента когда праймеры уже не могут отжечся на "неправильной" матрице. Когда фермент добавляется в реакционную смесь при комнатной температуре, он неактивен и, таким образом, не может работать с праймерами. Если даже некоторые праймеры отожглись на "неправильной" матрице, из-за отсутствия активности у фермента неспецифический продукт не будет синтезирован и наработан в процессе ПЦР. При использовании HotTaq полимеразы рекомендуется 10-минутная инкубация при 94 °C, что служит двум целям: - полной денатурации праймеров и матрицы для исключения неправильного отжига; - начальной активации HotTaq полимеразы. При использовании HotTaq полимеразы стандартный протокол постановки ПЦР практически не претерпевает изменений, но в результате получается выигрыш специфичности, чувствительности и количестве конечного продукта. ПЦР с HotTaq полимеразой шаг за шагом Эффективная активация является критическим моментом для использования HotTaq полимеразы и зависит от трех основных факторов:
Время инкубации и температура Для активации HotTaq полимеразы мы рекомендуем минимум 10 минут инкубации перед ПЦР при 94 °C, затем 25 - 35 циклов амплификации. Инкубация перед ПЦР при 94 °C в течении 10 минут приводит к активации прибл. 40% фермента, необходимого для эффективной амплификации на начальных стадиях ПЦР, пока амплифицируемой матрицы еще мало. Поскольку фермент активируется на каждом цикле во время стадии денатурации, активность фермента растет вместе с количеством амплифицируемой матрицы, обеспечивая наиболее оптимальный процесс ПЦР. При более низкой температуре активации, ниже чем 94 °C, может активироваться недостаточное количество фермента, что может потребовать компенсации в виде дополнительных циклов, либо увеличения время инкубации. Активация при температуре более высокой, чем 94 °C, может приводить к необратимой денатурации фермента. Поэтому мы настоятельно не рекомендуем при активации превышать 94 °C. Оптимальное время и температура активации может меняться в зависимости от модели амплификатора и требует эмпирического подбора. Если есть вероятность недостаточной активации, мы рекомендуем увеличить число циклов и время стадии денатурации в каждом цикле. Это лучше и надежнее, чем увеличение времени активации. рН Для HotTaq полимеразы мы рекомендуем использовать наш стандартный HotTaq буфер. Мы не рекомендуем использование не-Трис содержащих буферов и буферов с KCl. Есть еще несколько моментов, которые могут оказывать существенное влияние на ионный состав и/или pH реакции:
Дополнительные факторы, влияющие на эффективность работы HotTaq полимеразы Температура отжига и выбор праймеров Когда вы подбираете праймеры для ПЦР, важно, чтобы:
Вероятность неспецифического отжига возрастает в зависимости от:
Благодаря своим особенностям HotTaq полимераза позволяет успешно преодолевать эти проблемы. Поскольку HotTaq полимераза дает возможность праймерам отжигаться на матрице со 100% гомологией, мы не рекомендуем использовать HotTaq полимеразу для ПЦР, где требуется нестрогий отжиг праймеров (вырожденный ПЦР и т.п.). Концентрация хлорида магния Мы рекомендуем использовать для HotTaq полимеразы концентрацию MgCl2 в пределах 1.5-4.0 mM. Однако, оптимальную концентрацию MgCl2 для конкретной системы праймеров, как правило, приходится подбирать эмперически. Высокая концентрация MgCl2 может приводить к образованию неспецифических продуктов. Нужно помнить, что концентрация ДНК в образце и количество dNTP в реакционной смеси влияют, и иногда значительно, на концентрацию MgCl2. Матрица Качество препарата ДНК играет важную роль для успешной ПЦР. Препарат может содержать примеси, ингибирующие ферментативную активность. Избыток ДНК в пробе может приводить к образованию неспецифических продуктов. Применение HotTaq полимеразы позволяет получать в подобных случаях хорошие результаты, даже при наличии в пробе малого количества ДНК затравки или частично деградировавшей ДНК, где содержание ДНК затравки очень незначительно. Дезокситрифосфаты Обычно в ПЦР используют 200-250 µM каждого dNTP. Для длинного чтения концентацию можно незначительно увеличить. Однако, избыток dNTP может снижать точность работы фермента. Для более точного чтения мы рекомендуем использовать низкие концентрации dNTP (15-20 µM каждого). Амплификатор В дополнение ко всем перечисленным моментам, влияющим на эффективность использования HotTaq полимеразы, следует отнести особенности работы конкретного амплификатора. Необходимость подбора оптимальных условий цикла полностью зависит от технических параметров прибора.
©2004 ЗАО "Силекс". Все права защищены. Контакты: ЗАО "Силекс" - Заказы и вопросы: info@sileks.com, тел./факс (495) 737 42 24, тел. (495) 998 42 88
