Синтез кДНК (обратная транскрипция)

В приводимом ниже протоколе мы предлагаем процедуру, которую считаем оптимальной. В соответствии со своими задачами вы можете модифицировать данную процедуру.

Как уже отмечалось выше, обратная транскрипция может проводится с использованием различных праймеров. Используйте набор с олиго(дТ)15 праймерами, если вы собираетесь исследовать 3’ район РНК или хотите в дальнейшем клонировать кДНК. Набор со случайными гексапраймерами более универсален. Он пригоден для исследования РНК по всей длине и в особенности 5’ района РНК.

1. В пробирке, помещенной в лед, смешайте следующие компоненты:
   
   • РНК матрица 2 мкл
     тотальная РНК 0.1 - 5 мкг
     или поли(А)+ РНК 10 - 0.5 нг
     или специфическая РНК 0.01 пг и меньше
   • праймер 1 мкл
     специфический 15 - 20 пмолей
     или случайный гексапраймер 0.5 мкг (1мкл)
     или олиго(дТ)15 0.5 мкг (1мкл)
   • вода, свободная от РНКаз до 18 мкл
   Перемешайте, осадите капли кратковременным центрифугированием.
2. Инкубируйте смесь 5 мин при +70 С, перенесите пробирку в лед и соберите капли кратковременным центрифугированием.
3. Поместите пробирку в лед и добавьте следующие компоненты:
   • х10-кратный ОТ буфер 2.5 мкл
   • 2.5 mM смесь dNTP 4 мкл
   • MMLV обратная транскриптаза 0.5 мкл
4. Инкубируйте смесь в течении 60 мин при +37 градусах по Цельсию (при использовании случайных гексапраймеров перед инкубацией при +37 градусах по Цельсию проинкубируйте смесь в течении 10 мин при +25 градусах по Цельсию и затем инкубируйте смесь в течении 60 мин при +37 С).
5. Остановите реакцию прогреванием смеси в течении 10 мин при +70 градусов по Цельсию. Перенесите смесь в лед. Полученная кДНК может быть непосредственно сразу же использована для ПЦР или синтеза второй цепи и последующего клонирования. Храните синтезированную кДНК при -20 градусах по Цельсию или при -70 градусах по Цельсию для долгосрочного хранения.

Также читайте полную версию статьи.